エンドサイトーシス小胞形成の生物物理学：液液相分離への焦点 (2023)

エンドサイトーシス構造の形状とサイズは、エンドサイトーシスメカニズムによって異なります。CMEは、直径60〜120nmの球状小胞を生成しますが、他のエンドサイトーシスメカニズムは、サイズが大きく異なる非常に多様な尿細管を生成します[4,5]。これらの構造のそれぞれは、エンドサイトーシス構造が陥入するときにPMを変形させる必要があります。エンドサイトーシス機構は、さまざまなサイズと形態学で膜の湾曲をどのように促進しますか？

構造化されたタンパク質ドメインがエンドサイトーシス中にどのようにして膜の湾曲を生成するかを理解するために広範な努力がなされてきた。特に、三日月型の Bin/Amphiphysin/Rvs (BAR) ドメインと両親媒性ヘリックス挿入は、エンドサイトーシスタンパク質が PM に曲率を与えるために使用する 2 つの重要なツールです [6]。おそらく驚くべきことに、3D 構造を欠くタンパク質ドメインも膜の湾曲を促進する可能性があります [7、8、9∗、10]。本質的に無秩序な領域 (IDR) と呼ばれるこれらのドメインは、膜の屈曲を駆動します。タンパク質の混雑機構;大きな無秩序な領域を持つタンパク質が十分に密集したレベルで PM に結合すると、結果として生じる局所的な立体圧力が膜の屈曲によって緩和されます [7]。 CME の多くのアダプタータンパク質は、構造化された曲率を課すドメインと非構造化 IDR を組み合わせています (表 2 を参照)。この組み合わせは、エンドサイトーシスタンパク質が膜湾曲を誘導および安定化できるようにする強力な生物物理学的メカニズムを表しており、CME を超えたエンドサイトーシスメカニズムに共通であると考えられます。

一般に、構造化タンパク質ドメイン、IDR 関連タンパク質のクラウディング、脂質組成、タンパク質結合速度論など、複数の機構が連携して局所的な膜変形を引き起こします [11*、12、13]。これは、CME 中にエプシンによって引き起こされる膜の曲がりの場合に当てはまります。エプシン N 末端相同性 (ENTH) ドメインは、リン脂質のホスファチジルイノシトール-4,5-二リン酸 (PI(4,5)P) と連携して機能します。₂）膜への両親媒性ヘリックス挿入を通じて膜曲率を促進する[14,15]。さらに、最近の研究により、EnthとPi（4,5）Pがある別の生物物理学的メカニズムを照らしました。₂相互作用は、CMEで膜曲率を生成します。具体的には、Pi（4,5）p₂高度な膜曲率を生成するために必要な局所的なタンパク質アセンブリを可能にするエンエンオリゴマー化を促進します[13]。ここでは、エプシンヘリックス挿入、即位オリゴマー化、またはエプシンのC末端障害ドメインの立体群によって生成される膜曲率は、CME中にPMを変形させるのに必要なエネルギー障壁を克服するには個別に不十分な場合があります。ただし、これらのメカニズムの組み合わせにより、エプシンは膜曲率の強力なドライバーになります。

エンドサイトーシス構造の形成中に平坦な膜から高度に湾曲した膜への変化を促進するには、膜上のエンドサイトーシスタンパク質機構が、形状変化に適応し続けながら、増加する曲率を安定化する必要があります。 CME におけるクラスリンの本質的な役割については議論されています。クラスリンは膜の湾曲を生成するのでしょうか、それとも湾曲を安定させるだけなのでしょうか? [16,17]。いくつかの最近の研究は、クラスリンが湾曲を安定させるのに重要であることを示唆しています。具体的には、下にあるナノパターン基板によって湾曲した膜では、CME 中のクラスリンの必要量が減少し、クラスリンの本質的な役割が湾曲した膜を安定化することであることが示されています [18]。さらに、追加の要因がクラスリンコートの曲率に規制を課す可能性があります。クラスリン軽鎖 (CLC) サブユニットは、集合格子の柔軟性を制御します [19]。 CLC スプライセオフォームの多様性により、クラスリンで覆われた小胞に細胞型特異的な曲率が生じる可能性があります [19]。コート構築中の再配列をさらに刺激するために、ATPase Hsc70 や GAK (サイクリン G 関連キナーゼ) などの脱コートタンパク質が存在します。これらは、曲率が変化する CME の初期段階でクラスリン交換を積極的に駆動します [20,21]。最も顕著です[22]。

NCEでは、クラスリンのようなコーティングタンパク質の欠如は、膜の曲率を駆動するために他のメカニズムの必要性を必要とします。この場合、皮質アクチン重合などの細胞骨格、およびBARドメイン含有タンパク質の作用との協力（たとえば、clic-geek [23]のIRSP53およびpick1またはfeme [24]）プレイプレイ膜の曲げ、尿細管における重要な役割であり、最終的には小胞の核分裂にも責任があります（詳細については第3章を参照）。注目すべきことに、哺乳類細胞におけるCMEにおけるアクチンの役割は一般にいくつかの例外を除いて不可欠です（詳細については第3章を参照）。膜の曲げと小胞の内向きの成長を駆動します[25]。

エンドサイトーシスタンパク質のIDRは、多様な生物物理学的メカニズムを介してエンドサイトーシス構造を組み立てるのに役立ちます（表2を参照）。そのアミノ酸配列と散在する相互作用モチーフに応じて、膜境界であるIDRは、動的自己組織化のために立体的に反発力[8,26]または弱い引力[27,28]を促進できます。これらの力は、基礎となる膜に反対の影響をもたらします。IDR間の立体反発は、膜の曲率を駆動します離れてタンパク質層。向かってタンパク質層 (図 1) [29,30]。 IDR間の弱い相互作用は、多くの細胞プロセスの動的な空間的および時間的組織化を可能にする生物物理学的現象である液液相分離（LLPS）の可能性を示しています[31、32]。近年、LLPS は、Wnt シグナル伝達、T 細胞受容体シグナル伝達、アクチン構築などのいくつかの経路の重要なステップを推進することが示されています [33、34、35]。エンドサイトーシスの文脈では、弱く相互接続されたタンパク質ネットワークは、膜でエンドサイトーシス機構を組み立てるための一般的な機構を提供する能力を持っています。具体的には、LLPSによって構築されたタンパク質ネットワークは、迅速な小胞形成に必要な機械的柔軟性と動的再配列を提供する可能性があります。エンドサイトーシスアダプターにおけるIDRの普及により、エンドサイトーシスの重要なステップを推進する手段として、タンパク質構築のこの生物物理学的機構に注目が集まっています。

最近の研究では、CME における液体状の集合の重要性が実証されました。イニシエータータンパク質は、クラスリンコートピット（CCP）集合中に最も早く到着する[36,37]が、膜上の小さな領域へのピット成分の局在を維持しながら、下流のアダプタータンパク質を動員する必要がある。このような 2 つのイニシエータータンパク質、Eps15 と FCHo が LLPS に関与することが示されました。試験管内で[38]。酵母細胞と哺乳類細胞の両方で、これらのタンパク質は分子交換率が高い動的集合体を形成しました[38,39]。重要なことに、イニシエーターネットワークにおけるタンパク質間の相互作用の強さは、CMEの全体的なダイナミクスに影響を与えました。相互作用の喪失は、小胞を形成する前に中止したCCPをもたらし、相互作用が強化されたため、失速した長寿命のピットが生じました[38]。これらの調査結果は、CME中にタンパク質ネットワークを構築するための要件を説明するのに役立ちます。重要なことに、LLPはタンパク質間の弱い相互作用に依存しており、これはIDRS、ホモオリゴマー化、グリコシル化[40]、またはSH3とプロリンリッチドメインの結合などの一般的なタンパク質モチーフによって促進される可能性があります。このようなタンパク質の特徴は、キャビンを含む多くの種類のエンドサイトーシスタンパク質に豊富です[5,41,42]。重要なことに、他のエンドサイトーシスタンパク質にはほとんど障害のない領域がありません。たとえば、IDRはCMEの初期段階でより一般的であり、後のステップではあまり一般的ではありません。LLPはCMEの一部の段階で特徴付けられていますが、将来、CMEの開始だけでなく、他のエンドサイトーシスメカニズムも促進する共通の堅牢なメカニズムであることが証明される可能性があります[43]。ただし、この仮説を調査するには、さらに作業が必要になります。

貨物の選択に続いて、エンドサイトーシス機構の組み立てとPMの曲げに深く陥入した出芽小胞を形成するには、遊離エンドサイトーシス小胞を生成するために核分裂が必要です。GTPaseタンパク質ファミリーとダイナミンは、CMEおよびいくつかのNCEメカニズムのこの分裂ステップにとって重要です。ダイナミンは細胞のコンテキストの調節を示します：ダイナミン1（DYN1）はニューロンの小胞エンドサイトーシスとリサイクルに不可欠ですが、ダイナミン2（DYN2）は、すべての細胞タイプにおける構成的およびリガンド誘発性エンドサイトーシスの原因です[44]。しかし、最近の研究では、DYN1は非神経細胞でも発現し、GSK3β依存性のリン酸化によって負に調節され、特定のリガンドによって活性化されることが示されました。機械的には、エンドサイトーシス部位へのダイナミンの動員は、インターセクチン、両親媒性、エンドフィリンなどのSH3ドメイン含有タンパク質への結合に依存します[44]。両親媒性とエンドフィリンは、膜の曲率と出芽膜の収縮の原因となるBARドメインも持っています。最後に、DynaminのGTPase活性は、膜核分裂につながる立体構造の変化の原因です[44]（図2a）。

細胞骨格は、膜の曲率における役割に加えて、小胞の出芽にも重要です。皮質アクチンの高粘性フィラメントへの重合は、酵母細胞の非常に高い膨圧を超える十分な力を生成し、小胞の内側への成長とその分裂を可能にするのに十分である[25]。機構的には、アクチン重合によって生成される圧縮力は、架橋アクチンネットワークを作成し、化学結合エネルギーを弾性エネルギーに変換するアクチン結合タンパク質によって大幅に増加します[47]。しかし、哺乳動物細胞では一般にアクチンはCMEの分裂には必要ありませんが、アクチン重合とアクチン調節因子Arp 2/3、コルタクチン、N-Waspは分極した上皮細胞の頂端面で起こるCMEの陥入と分裂イベントに重要です。または、高い PM 張力にさらされる細胞でも必要です [48]。最近の発見は、CME における細胞骨格と組み合わせたモータータンパク質の役割も強調しています。例えば、アクチンモータータンパク質であるミオシン VI の長いアイソフォームは、CLCa との選択的相互作用を通じて CCP に動員され、おそらく頸部の収縮と分極した上皮の頂端面の小胞の放出を完了するのに必要な引っ張り力を提供することが示されています。 [49] (図2b)。

アクチン重合は、CLIC/GEEC エンドサイトーシスや FEME など、いくつかの NCE 機構の分裂ステップで重要です [50] (図 2c)。さらに、ダイナミンの役割は主に CME で特徴付けられていますが、カベオラ [51] や EGFR-NCE [52] など、一部の NCE 経路の分裂ステップもダイナミンに依存しています。しかし、CLIC/GEEC エンドサイトーシス [2] および FEME [5] における一部の NCE 尿細管陥入の分裂において、ダイナミンは不要であるか、エンドフィリン A2 などの BAR ドメイン含有タンパク質と協力します。確かに、摩擦による切断(FDS) メカニズムでは、アクチン重合によって助けられた細管自体の伸長が、核分裂を引き起こすのに十分な強い引張力を生み出すことができます。膜張力の増加とその結果として生じる破裂は、管の基部を固定するタンパク質足場と、微小管上を歩くモータータンパク質（ダイニンなど）によってもたらされる引っ張り力との間の摩擦に起因する[53]。 N-BAR タンパク質 Bin 1 であり、キナーゼ Cdk5 および GSK3β によって負に制御されます [54] (図 2d)。

したがって、FDSモデルでは、BARドメインを含むタンパク質の役割は、膜管を安定化し、脂質の拡散障壁として機能するために必要な剛性足場の古典的な視覚と一致しています。しかし、最近、この視力が挑戦されており、BARドメインを含むタンパク質がIDR含有タンパク質を混雑させることにより、膜分裂のドライバー自体として出現しています[9]。実際、上記のように（セクションは曲線の前に進む：膜湾曲を安定化するための生物物理学的メカニズム）、タンパク質の混雑メカニズム、混雑したタンパク質間のランダムな衝突は、立体圧力を生成し、膜曲率を増加させ、最終的に核分裂を引き起こします（図2E）。実際、両親媒性やFCHO1/2などのBARドメインを含むタンパク質には、長いIDR（表2を参照）を頻繁に含み、その分離されたBARドメインは巨大な単層小胞（GUV）の安定化膜管を安定化し、全長タンパク質がこれらの尿細管を破壊しました。彼らの小素につながり、核分裂におけるIDRの重要性を強調します[9]。

最後に、ダイナミンはマルチフィラメントのアクチン束形成タンパク質であり、GTPase 活性を通じて Arp2/3 を介した新しい分岐アクチンフィラメントの集合を促進することにより、アクチン束の機械的強度を調節することが示されました。ショウジョウバエ[55]、このメカニズムはエンドサイトーシス分裂にも関与している可能性があります。しかし、Arp2/3複合体を介した分岐アクチンネットワークは、不安定化する切断効果ではなく、尿細管陥入に対して安定化効果があることも示されている[56]。したがって、アクチンネットワークの動態の変化により、尿細管の成熟、安定性、分裂を制御できる可能性があります。